El objetivo principal de este trabajo fue el análisis de los mecanismos moleculares que rigen la actividad de las proteínas reguladoras CcpA y LacT en la bacteria ácido láctica Lactobacillus casei. Estos dos reguladores representan dos paradigmas de procesos de control estimulados por la presencia de carbohidratos y están conectados entre sí por un complejo sistema de transferencia de grupos fosfato, que tiene como protagonistas los elementos generales del sistema de transporte de azúcares PTS.
En L. casei, el uso preferencial de las fuentes de carbono está regulado por el mecanismo de represión por catabolito (RC) (Monedero et al., 1997). Al igual que en otras bacterias Gram-positivas de bajo contenido en G+C, la RC tiene lugar a través de la unión del represor transcripcional CcpA (Miwa et al., 1994; Hueck et al., 1995; Egeter & Brückner, 1996; Lokman et al., 1997; Leboeuf et al., 2000a) a la secuencia operadora cre (catabolite responsive element) (Fujita et al., 1995; Aung-Hilbrich et al., 2002). La unión de CcpA a la secuencia cre se ve fuertemente estimulada por la forma fosforilada en la serina 46 de la proteína HPr (P-ser-HPr), un importante componente del sistema fosfotransferasa dependiente de fosfoenolpiruvato (PTS) (Deutscher et al., 1995; Jones et al., 1997). De este modo se relaciona la RC con el proceso de transporte de azúcares por el PTS (Brückner & Titgemeyer, 2002). La inactivación de CcpA presenta un efecto pleiotrópico, afectando a la expresión de aproximadamente un 8% de los genes en Bacillus subtillis (Moreno et al., 2001). Los fenotipos tradicionalmente observados en una cepa con el gen ccpA inactivado son: una pérdida de RC de operones que codifican proteínas para la asimilación de fuentes de carbono secundarias y un defecto en la velocidad de crecimiento.
Para abordar el primer apartado del objetivo principal de la presente tesis (Estudio de la represión por catabolito: análisis mutacional de los dominios de unión al DNA y al correpresor de CcpA), se construyó una serie de mutantes en el gen ccpA de Lactobacillus casei para estudiar su efecto sobre la represión por catabolito y el defecto de crecimiento. Las mutaciones se eligieron en función de trabajos previos en el CcpA de Bacillus megaterium que identificaban residuos de aminoácidos que afectaban a la RC y/o al crecimiento (Küster et al., 1999a; Küster et al., 1999b). Inicialmente se planeó evaluar el efecto de estas mutaciones en un sistema heterólogo, como una cepa de Bacillus megaterium con el gen ccpA propio deleccionado (B. megaterium WH353), por una mayor facilidad de manejo experimental. El uso de sistemas heterólogos para el estudio de elementos del sistema de represion por catabolito en Gram-positivos no es inusual, por ejemplo se ha utilizado B. subtilis para la caracterización de mutantes de la HPr kinasa/fosfatasa de L. casei (Monedero et al., 2001). Sin embargo la expresión del gen ccpA de tipo salvaje en la cepa WH353 de B. megaterium no complementó el fenotipo de pérdida de represión por catabolito. Este fue un resultado inesperado pues existían ejemplos de complementación heteróloga entre diversas especies de Gram-positivos, incluyendo la complementación de una cepa de B. subtilis mutante en ccpA con el ccpA de L. casei (Davison et al., 1995; Egeter & Brückner, 1996; Monedero et al., 1997; Schick et al., 1999). Tras esta observación, se consideró interesante averiguar las causas moleculares de la no complementación de ccpA de L. casei en B. megaterium.
En el complejo ternario cre/CcpA/P-ser-HPr, CcpA interacciona con los otros dos componentes, por lo que el fenotipo de no complementación observado puede ser debido a un fallo en la interacción cre/CcpA (DNA-proteína) o en CcpA/P-ser-HPr (proteína-proteína). Para dilucidar esto, se ensayó la capacidad de unión de CcpA de L. casei a secuencias cre de L. casei y B. megaterium en presencia o ausencia de P-ser-HPr de L. casei y B. megaterium por retardo de la migración en gel. La proteína CcpA de L. casei interaccionó eficientemente con las secuencias cre de L. casei y B. megaterium en presencia de P-ser-HPr de L. casei, pero no en presencia de P-ser-HPr de B. megaterium, indicando una baja interacción proteína-proteína entre CcpA de L. casei y HPr-ser-P de B. megaterium. En el mismo experimento, la proteína CcpA de B. megaterium fue capaz de unirse a su propia secuencia cre en presencia de P-ser-HPr de Lactobacillus casei, sugiriendo que la interacción heterologa entre dos componentes no siempre es recíproca. Para estudiar la afinidad entre CcpA y P-ser-HPr de un modo más preciso, se utilizó la técnica de resonancia de plasmón de superficie (RPS). La RPS permitió una estimación de la constante de disociación aparente entre estas dos proteínas, resultando para el par CcpA y P-ser-HPr de L. casei 3.9 x 10-6 M, mientras que en el caso CcpA de L. casei y P-ser-HPr de B. megaterium la KD aparente fue de 2.0 x 10-5 M, cinco veces mayor (más tendencia a disociarse).
Como se ha comentado, con el fin de determinar los residuos de CcpA implicados en el defecto de crecimiento y en la función represora, una colección de ccpAs mutantes fue estudiada en L. casei. Para ello se construyó BL190, una cepa de L. casei con el gen ccpA completamente deleccionado y se transformó con derivados del plásmido pGAL9 (Pérez-Martínez et al., 1992) portando los mutantes T7S, R50H, N52S, F78C, S80L, M283V y T307I equivalentes a los caracterizados en el ccpA de B. megaterium (Küster et al., 1999a; Küster et al., 1999b). CcpA pertenece a la familia LacI/GalR de proteínas reguladoras (Weikert & Adhya, 1992). La estructura obtenida por difración de rayos X por cristales de PurR, un miembro de esta familia, indica que esta proteína posee tres unidades funcionales: un dominio de unión al DNA (DBD) en el extremo amino terminal, conteniendo un motivo hélice-vuelta-hélice (HVH), un dominio de unión al correpresor (CBD) en el extremo carboxilo terminal y una hélice “visagra” que conecta ambos dominios aunque se considera que pertenece al DBD porque interacciona con el surco menor del DNA (Schumaker et al., 1994). Las hélices del DBD son muy sensibles a las mutaciones y normalmente las modificaciones en estas zonas resultan en proteínas con fallo en la unión a la zona operadora (Gordon et al., 1998; Kleina et al., 1990). Las mutaciones T7S y N52S del CcpA de L. casei están localizadas en la hélice posicionadora del motivo HVH y en la hélice visagra, respectivamente. Estas mutaciones en el DBD presentan el mismo fenotipo que las correspondientes en B. megaterium, pérdida (al menos parcial) de la RC al crecer sobre un azúcar represor como es la glucosa (Küster et al., 1999a).
El dominio de unión al correpresor contiene dos subdominios similares y está estructuralmente relacionado con las proteínas de unión de azúcares del periplasma de bacterias (Müller-Hill, 1983). Cada subdominio del CBD está formado por un núcleo de hojas b rodeado de a hélices. La cadena polipeptídica cruza tres veces de un subdominio a otro, conectándolos y permitiendo un cierto movimiento entre ellos en respuesta a la unión o liberación del cofactor (Sharff et al., 1992; Olah et al., 1993). El principal cofactor de la subfamilia CcpA es el P-ser-HPr, incluso se ha identificado una zona en la superficie de CcpA implicada en la interacción con P-ser-HPr (Jones et al., 1997; Kraus et al., 1998), pero algunas moléculas pequeñas como la fructosa-1,6-P, la glucosa-6-P o el NADP también pueden influir en la interacción entre CcpA y la secuencia cre (Gosseringer et al, 1997; Kim et al., 1998). Las mutaciones equivalentes a F78C, M283V y T307I tienen en B. megaterium el fenotipo de RC constitutiva (represión independiente de la presencia de glucosa) (Küster et al., 1999b), pero el efecto en L. casei es completamente diferente. En el represor del operón de la lactosa de E. coli, LacI, el hueco de unión del correpresor se encuentra entre los dos subdominios del CBD. Este hueco de unión establece puentes de hidrógeno (residuos Asn246, Arg197 y Asp149) y una superficie hidrofóbica (Leu73, Ala75, Pro76, Ile79, Trp220 y Phe293) para interaccionar con el correpresor IPTG (Lewis et al., 1996). Las mutaciones F78C y S80L de L. casei se encuentran próximas al hueco de unión al correpresor y mientras que F78C no produjo ningún efecto sobre la RC, S80L mostró hiperrepresión en presencia de glucosa (expresión del marcador no detectable en glucosa cuando en el tipo salvaje existe una expresión residual) y ningún efecto en ribosa. El cambio de serina por leucina en el hueco de unión del correpresor puede aumentar el ambiente hidrofóbico produciendo una unión más estable del correpresor aumentando la actividad de CcpA, esto solo ocurriría en presencia de glucosa. El residuo de aminoácido análogo a M283 en LacI y PurR (Tyr282) interviene en la dimerización de los dominios de unión al correpresor (Schumaker et al., 1994; Friedman et al., 1995). En L. casei la mutación M283V no tiene efecto sobre la RC, aunque esta mutación confiere RC constitutiva en B. megaterium (Küster et al., 1999b). T307I presentó el mismo fenotipo de hiperepresión en glucosa que S80L. Este residuo de treonina se encuentra conservado entre los miembros de la subfamilia CcpA pero no entre otros miembros de la familia LacI-GalR (Kraus et al., 1998). Solo otra proteína de la subfamilia CcpA, RegA de Clostridium acetobutilicum, presenta una isoleucina en esta posición. La expresión de RegA en una cepa de B. subtilis mutante en ccpA produce RC constitutiva (Davison et al., 1995).
Ninguna de las mutaciones del CBD estudiadas en L. casei tiene el mismo efecto que las correspondientes mutaciones en el CcpA de B. megaterium. Esto sugiere que aunque la señal de RC es eficientemente transmitida en ambas bacterias, los residuos de aminoácidos implicados y los cambios moleculares en CcpA causados por interacción con el cofactor(es) pueden ser diferentes en ambas especies. Esto se ve apoyado por las posibles diferencias estructurales puestas de manifiesto por la falta de complementación de la RC por el CcpA de L. casei en una cepa de B. megaterium con el gen ccpA deleccionado, que como se ha comentado anteriormente es debido a una interacción ineficiente entre el CcpA de L. casei y P-ser-HPr de B. megaterium (Mahr et al., 2002). Todo lo anterior sugiere que los residuos de aminoácidos conservados en posiciones equivalentes de las proteínas Ccpa de L. casei y B. megaterium podrían no siempre desempeñar la misma función en ambas especies.
A parte de la pérdida de RC otro fenotipo característico de las cepas con el gen ccpA inactivado es una reducción en la capacidad de crecimiento (Miwa et al., 1994; Hueck et al., 1995; Monedero et al., 1997; Leboeuf et al., 2000a). Se ha propuesto que este defecto de crecimiento, en B. subtillis, puede estar relacionado con la pérdida de expresión del operón gltAB que codifica para la glutamato sintasa (necesaria para la asimilación de amonio) (Faires et al., 1999) y el operón ilv-leu (biosíntesis de aminoácidos ramificados) (Ludwig et al., 2002). Las mutaciones estudiadas en el CcpA de L. casei, muestran que el efecto sobre el crecimiento es completamente independiente del efecto sobre la RC. La mutación F78C presenta el mayor incremento en el tiempo de duplicación y sin embargo se comporta como el tipo salvaje respecto a la RC. Y en los mutantes afectados en la RC, T7S y N52S, los desreprimidos, y S80L y T307I, los hiperrepremidos, no puede observarse ningún patrón que relacione la tasa de crecimiento con el efecto sobre la RC.
El trabajo realizado brinda la posibilidad de estudiar con mayor detalle las interacciones macromoleculares en el prodeso de RC. En el anexo 2 se describe la puesta a punto de una metodología basada en la RPS que permite el estudio de la interacción proteína-DNA entre CcpA (o el complejo CcpA / P-ser-HPr) y la secuencia cre. Este procedimento podría emplearse para caracterizar los mutantes de CcpA. Asimismo, será de gran interés tecnológico el estudio del metabolismo de las cepas desreprimidas y de las hiperreprimidas, por ejemplo determinación del patrón de metabolitos finales por cromatografía de gases y espectrometría de masas y/o estudio de la expresión de genes relacionados con el metabolismo de carbohidratos. A este respecto, cabe mencionar que actualmente en nuestro laboratorio se esta diseñando un experimento de hibridación de matrices de DNA que permitirá el estudiar la expresión de genes del transporte y metabolismo de carbohidratos en estas y otras cepas.
De acuerdo con el segundo apartado del objetivo principal de la Tesis (Estudio de la inducción por sustrato: Regulación por fosforilación de la actividad de la proteína antiterminadora LacT), se estudió LacT, antiterminador de la familia de BglG que regula la expresión del operón de la lactosa en L. casei. En BL23, la lactosa es trasportada por un PTS, los elementos específicos de este PTS, así como una P-b-galactosidasa y el propio LacT están codificados en el operón lac. La actividad de LacT está controlada por los elementos generales del PTS y el enzima II de la lactosa en respuesta a la presencia de lactosa y/o glucosa en el medio de cultivo (Monedero et al., 1997; Gosalbes et al., 1999; Viana et al., 2000). El estudio de las secuencias de los miembros de la familia BglG pone de manifiesto una estructura modular, estando formados por una zona de unión al RNA y dos dominios regulados por PTS (PRD-I y PRD-II). Normalmente existen cuatros sitios potenciales de fosforilación en histidinas bien conservadas, dos en cada PRD. BglG supone una excepción al no presentar la segunda histidina del PRD-II.
En todos los miembros de la familia BglG, la actividad reguladora está inducida por sustrato mediada por intercambio de fosfato con los elementos EII del PTS específico del azúcar transportado (Stülke et al., 1998). Estudios trascripcionales del operón lac en L. casei, muestran una actividad antiterminadora independiente de inductor en mutantes LacE y LacF (Gosalbes et al., 1999). Según el modelo de regulación de antiterminadores por el PTS (Stülke et al., 1998), EIILac desfosforilaría las histidinas del PRD-I de LacT en presencia de lactosa dando la forma activa. El alineamiento de secuencias de diferentes antiterminadores identifican dos histidinas conservadas en las posiciones 101 y 159 del PRD-I y otras dos, 210 y 273, en el PRD-II de LacT. La mutación H101A y la H159A confirieron actividad a LacT en ausencia de inductor (células crecidas en ribosa), aunque la actividad P-b-galactosidasa en cepas portando estas mutaciones fue inferior a la detectada en presencia de inductor (células crecidas en lactosa). Esto sugiere un efecto aditivo y que ambas histidinas deben estar desfosforiladas para obtener la máxima actividad de LacT.
La actividad de LacT es sensible a la presencia de glucosa, dando lugar a la RC independiente de CcpA del operón lac (Monedero et al., 1997; Gosalbes et al., 1999; Viana et al., 2000). En otros antiterminadores este efecto esta mediado por fosforilación en el PRD-II por P-His-HPr, aunque hay una cierta variabilidad en las histidinas fosforiladas y el efecto que supone. La pérdida total de actividad de los mutantes H210A y H273A al crecer sobre lactosa sugiere que ambas histidinas deben estar fosforiladas para obtener la forma activa de LacT. Para evitar que la RC debida a CcpA en células crecidas en glucosa más lactosa no permitiese observar la implicación de las histidinas 210 y 273 en la RC independiente de CcpA, los plásmidos conteniendo las mutaciones en dichas histidinas se introdujeron en la cepa BL190 (DccpA). Inesperadamente, el plásmido conteniendo la forma salvaje de LacT originó un fenotipo desreprimido, probablemente debido a la sobreexpresión de LacT desde un promotor constitutivo en un plásmido con alto número de copias. También se encontró expresión del operón lac cuando se expresó el mutante H210D en BL190, aunque la actividad fue menor de la que cabría esperar si el operón estuviese completamente activado. Esta mutación puede introducir cambios conformacionales que dificulten la formación del dímero, que es la forma activa de BglG en E. coli (Amster-Choder & Wright, 1992; Boss et al., 1999). La carga negativa introducida en el mutante H210D puede producir cambios estructurales que indirectamente alteren la zona de interacción entre los monómeros dentro del dímero. La expresión del mutante H210D en BL190 podría conducir a la formación de heterodímeros con el LacT de tipo salvaje codificado en el cromosoma, que tendrían una actividad antiterminadora parcial. La expresión en BL195 (DlacT) solo podría dar lugar a homodímeros inestables, explicando porque no presenta actividad en células crecidas en lactosa. La pérdida de actividad de los mutantes H210A y H273A en lactosa en cepas derivadas de BL195 y glucosa más lactosa en cepas derivadas de BL190 demuestran la implicación de las histidinas del PRD-II en la RC independiente de CcpA del operón lac. Aunque serán necesarios más experimentos para clarificar los mecanismos por los que la fosforilación regula la dimerización y la actividad de LacT, especialmente después de que Görke haya demostrado recientemente (2003) la transferencia de grupos fosfatos entre histidinas del PRD-I fosforiladas por P-his-HPr de un monómero a la histidina del PRD-II de otro monómero de BglG.
Para dar una salida aplicada a los conocimientos acumulados en nuestro laboratorio, se planteó como objetivo secundario de esta Tesis el uso del promotor del operón lac para regular la expresión de genes de interés. Como se ha comentado, el operón lac de L. casei se encuentra regulado por CcpA y LacT, repondiendo positivamente a la presencia del inductor, lactosa, y sufriendo RC en presencia de glucosa. Este sistema se ha utilizado para diseñar un vector integrativo (pILac) de grado alimentario. El vector pIlac, diseñado para clonar fragmentos de DNA entre los genes ‘lacG y lacF, permite la inserción del gen o genes de interés en el operón lac del cromosoma de L. casei. El uso de este vector permite la construcción de cepas integrantes que pueden expresar los genes de interés de un modo altamente regulado, siguiendo el mismo patrón de expresión que el operón lac. En el presente trabajo se comprobó la bondad del vector integrativo y del sistema de regulación para expresar genes heterólogos en L. casei integrados de manera estable, verificandose la ausencia del gen de resistencia a antibiótico y de DNA del plásmido en la cepa recombinante final, la permanencia de los genes insertados durante el crecimiento en medio MRS sin presión selectiva en pases sucesivos durante 50 días y que la expresión de los genes insertados sigue el patrón del operón lac. Este sistema de expresión ha sido patentado (ver anexo 3).
L. casei se usa como cultivo iniciador en algunos procesos fermentativos, especialmente en la producción de quesos y recientemente como probiótico en algunos productos lácteos. Sin embargo L. casei no es un buen productor de diacetilo y este es un compuesto muy deseable en productos lácteos fermentados por el aroma característico que les confiere. La acetohidroxiácido sintasa cataliza la condensación de piruvato en a-acetolactato que puede originar diacetilo por descarboxilación oxidativa. Especial interés tenía la utilización del plásmido pILac para integrar los genes ilvBN y expresar en L. casei el enzima acetohidroxiácido sintasa de Lactococcus lactis. La expresión de esta actividad enzimatica en las condiciones de inducción (células crecidas en lactosa) tuvo una serie de consecuencias: la primera a tener en cuenta es que se logró el objetivo deseado, se aumentó la cantidad de diacetilo producido 23 veces el nivel de la cepa control, en tres horas se produjo la misma cantidad de diacetilo que en cultivos de toda la noche de L. lactis expresando estos mismos enzimas (Bassit et al., 1993; Benson et al., 1996; Goupil et al., 1996; Swindell et al., 1996); y una serie de efectos secundarios debido al redireccionamiento de parte del flujo metabólico del piruvato, el primero de ellos fue, evidentemente, una fuerte disminución en la cantidad de lactato producido; la fermentación de piruvato a lactato permite regenerar el cofactor NAD+ oxidado a NADH durante la glucólisis, la ruta de la acetoína / 2,3-butanodiol, que se incrementa considerablemente a consecuencia de la producción de a-acetolactato, su sustrato inicial, no puede reoxidar estequiométricamente todo el NADH producido en la glucólisis, esto explica el fuerte aumento en la cantidad de etanol producido, dado que por esa ruta se puede reoxidar el doble de NADH que por la fermentación láctica y permite compensar la menor regeneración de cofactores a partir de compuestos derivados del a-acetolactato; el producto de la acetohidroxiácido sintasa es el inductor de la expresión de los genes que codifican los siguientes enzimas en la ruta de biosíntesis de aminoácidos ramificados (Arfin & Umbarger 1969), lo que hace que una parte importante del flujo metabólico a partir del piruvato se redirija a la formación de leucina, isoleucina y valina. Se comprobó el aumento de aminoácidos en el sobrenadanete y junto con el resto de compuestos determinados por cromatografia de gases explican una parte importante de la cantidad de lactato que ha dejado de producirse, pero no puede calcularse un balance de metabolitos porque esta es una parte muy intrincada del metabolismo y sería necesario analizar más compuestos para tener una visión completa de los flujos metabólicos que tienen lugar en esta cepa durante la sobreexpresión del enzima acetohidroxiácido sintasa. Esta cepa y otras derivadas de ella se emplearán un proyecto PETRI para el aprovechamiento biotecnológico de lactosuero en un reactor de células inmovilizadas.
