Tesis Doctoral: Caracterización molecular de la represión por catabolito e ingeniería metabólica en Lactobacillus casei.

Tesis defendida en la Universiad de Valencia en Enero de 2004 obteniendo la calificación de Sobresaliente «cum laude» y el Premio Extraordinario de Doctorado.

Autor: Carlos Esteban.

Introducción General.

I. Bacterias lácticas. Lactobacillus casei.

I.1. Bacterias lácticas.

I.2. Género Lactobacillus.

I.3. Lactobacillus casei.

I.4. Lactobacillus. casei BL23.

II. Metabolismo de hexosas y pentosas en bacterias lácticas.

II.1. División de las bacterias lácticas por sus características fermentativas.

II.2. Sistemas de transporte de azúcares.

II.3. Vía homofermentativa (glucólisis).

• II.3.1. Fermentación homoláctica de la glucosa.

II.4. Vía heterofermentativa (ruta de las pentosas fosfato).

• II.4.1. Fermentación heteroláctica de la glucosa.
• II.4.2. Metabolismo de pentosas.

II.5. Destinos alternativos del piruvato e ingeniería metabólica para la sobreproducción de diacetilo.

• II.5.1. Ruta del diacetilo / acetoína.
• II.5.2. Biosíntesis de aminoácidos ramificados.
• II.5.3. Ruta de la piruvato-formato liasa.
• II.5.4. Ruta de la piruvato deshidrogenasa.
• II.5.5. Ruta de la piruvato oxidasa.
• II.5.6. Influencia del oxígeno y NADH oxidasas.

III. Represión por catabolito en bacterias lácticas.

III.1. La represión por catabolito de carbono en bacterias Gram – y Gram +.

III.2. Transducción de señal por el sistema PTS/CcpA.

• III.2.1. Los sitios cre.
• III.2.2. La proteína CcpA.
• III.2.3. Fosforilación de la proteína HPr en la serina 46.
• III.2.4. Transporte de azúcares y activación de HprK/P.

III.3. Operones regulados por represión catabólica en bacterias lácticas.

III.4. Regulación global: glucólisis y metabolismo del nitrógeno.

• III.4.1. Regulación de genes glucolíticos en bacterias lácticas.
• III.4.2. Regulación del metabolismo del nitrógeno por CcpA.

IV. El metabolismo de la lactosa y regulación del operón lac en Lactobacillus casei.

IV.1. Transporte y metabolismo de la lactosa en bacterias lácticas.

• IV.1.1. Ruta de Leloir.
• IV.1.2. Ruta de la tagatosa-6-P.

IV.2. Estructura del operón lac de Lactobacillus casei BL23.

IV.3. Regulación del operón lac de Lactobacillus casei BL23.

V. Presentación de los trabajos y justificación de la unidad temática.

OBJETIVOS.

Capítulo 1. Cross communication between components of carbon catabolite repression of Lactobacillus casei and Bacillus megaterium.

• CcpA of L. casei cannot complement a B. megaterium ccpA mutant.
• Overproduction and purification of CcpA and Hpr of L. casei.
• In vitro analysis of the cre/CcpA/HPr-Ser-P complexes.
• Determination of equilibrium paramenters for cre/CcpA/HPr-Ser-P interactions.

Capítulo 2. Complementation of a DccpA mutant of Lactobacillus casei with CcpA mutations affecting the DNA and cofactor-binding domains.

• Delection of the L. casei ccpA gene.
• Mutagenesis of ccpA and expression of CcpA variants in BL190.
• Complementation of CCR by ccpA wild-type and mutant genes.
• Growth effect of ccpA mutations.

Capítulo 3. In vivo effect of mutations in the antiterminator LacT in Lactobacillus casei.

• Effect of mutations in His-101 and His-159 on LacT activity.
• Characterization of putative phosphorilation sites in the PRD-II of LacT.

Capítulo 4. Integrative Food-Grade Expression System Based on the Lactose Regulon of Lactobacillus casei.

• Integration strategy with vector pIlac.
• Chromosomal integration of E. coli gusA in L. casei.
• Construction of a food-grade ilvBN integrant of Lactobacillus casei.
• Determination of metabolic products in the ilvBN mutant.

Discusión general.

BIBLIOGRAFÍA GENERAL.

 

ANEXOS.

ANEXO 1. Probioticos, ¿qué son?, ¿qué hacen?.

1. Historia y definición.

2. Características.

• 2.1. Requerimientos de seguridad.
• 2.2. Características funcionales.
• 2.3. Aspectos tecnológicos.

3. Microbiología del sistema digestivo.

• 3.1. El sistema digestivo.
• 3.2. Microorganismos considerados probióticos.

4. Efectos beneficiosos.

• 4.1. Ayuda en la digestión de la lactosa.
• 4.2. Resistencia a los patógenos intestinales.
• 4.3. Prevención de las enfermedades urogenitales.
• 4.4. Modulación del sistema inmunitario y prevención de alergias.
• 4.5. Prevención del cáncer de colon.
• 4.6. Reducción del colesterol en sangre.
• 4.7. Efecto antihipertensión.

5. Visión crítica.

6. Bibliografía.

ANEXO 2. Study of the Protein-DNA Interaction Responsible for Carbon Catabolite Repression in Lactobacillus casei.

ANEXO 3. Patente: Uso de la secuencia de nucleótidos del promotor del operón de la lactosa de Lactobacillus casei para regular la expresión génica a través de una proteína antiterminadora.

Resumen.

Sector de la técnica.

Estado de la técnica.

Descripción de la invención.

Explicación detallada de los dibujos.

Ejemplos.

• Ejemplo 1. Expresión del gen gusA en multicopia.
• Ejemplo 2. Expresión del gen gusA integrado en el operón de la lactosa.
• Ejemplo 3. Expresión de los genes ilvBN integrados en el operón lactosa.

Lista de secuencias.

Reivindicaciones.